A dupla perdeu por 5-4(4) e 4-1 para Flavio Cobolli e Belinda Bencic logo após vencer o duelo de estreia contra Erin Routliffe e Lloyd Glasspool por 5-3 e 4-1.
Aos 44 anos, Williams mostrou entrosamento fácil com Alcaraz, que é 21 anos mais jovem. Juntos, os dois formaram a dupla mais vencedora da história, com 30 Grand Slams somados.
Cobolli e Bencic vão enfrentar o casal Elina Svitolina e Gael Monfils na semifinal desta quarta-feira.
"É sempre incrível estar aqui," disse Williams após o jogo. "Nunca imaginei que voltaria a jogar nesta quadra", acrescentou ela, que havia disputado o US Open pela última vez em 2022.
Confira a tabela das duplas mistas do US Open
Williams, que não jogará a chave simples, mostrou lampejos de sua potência na estreia contra Routliffe e Glasspool, disparando um ace de 193,1 km/h que arrancou suspiros da arquibancada lotada.
Alcaraz, que não jogava desde abril por conta de lesão, também produziu jogadas de efeito na rodada inicial.