Isner é o maior recordista em número de aces na história da ATP, com 14.411 pontos de serviço.
Ele detém também o saque mais rápido já registrado oficialmente, com uma bomba que atingiu 253 km/h na primeira rodada da Copa Davis de 2016.
O tenista estadunidense se tornou profissional em 2007 e chegou a ser número oito do mundo no auge da carreira.
Ele ganhou 16 títulos de simples, sendo o maior deles o título do Miami Open em 2018, sua temporada de maior sucesso.
"Depois de mais de 17 anos no ATP Tour, é hora de dizer adeus ao tênis profissional", disse Isner em suas redes sociais.
"Essa transição não será fácil, mas estou ansioso para aproveitar cada segundo com minha incrível família", disse Isner, que tem quatro filhos com sua esposa Madison.
"O US Open será meu último evento. Chegou a hora de colocar os cadarços pela última vez", acrescentou.
John Isner também fez história ao ganhar a partida de tênis profissional mais longa da história, que durou 11 horas e 5 minutos e precisou de três dias para acabar, em Wimbledon em 2010.
O All-England Club também foi o local de seu melhor resultado em um torneio do Grand Slam, tendo chegado às semifinais em 2018. Ele chegou duas vezes às quartas de final do US Open, em 2011 e 2018.